Imunohistokimia

Imunohistokimia merupakan suatu teknik penentuan keberadaan (lokasi) antigen (protein target) dalam jaringan atau sel menggunakan reaksi antigen-antibodi.  Teknik ini diawali dengan prosedur histoteknik yaitu prosedur pembuatan irisan jaringan (histologi) untuk diamati di bawah mikroskop. Histoteknik dijelaskan pada mata kuliah lain.  Irisan jaringan yang didapat kemudian memasuki prosedur imunohistokimia.
Interaksi antara antigen dan antibodi adalah reaksi yang tidak kasat mata.  Oleh karena itu, diperlukan visualisasi adanya ikatan tersebut dengan melabel antibodi yang digunakan dengan enzim atau fluorokrom.  Enzim (yang dipakai untuk melabel) selanjutnya direaksikan dengan substrat kromogen (yaitu substrat yang menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut) yang dapat diamati dengan mikroskop bright field (mikroskop bidang terang).  Imunohistokimia yang menggunakan fluorokrom untuk melabel antibodi, dapat langsung diamati (tanpa direaksikan lagi dengan kemikalia yang menghasilkan warna) di bawah mikroskop fluorescence.

Dasar-dasar Pembuatan Antibodi

Antibodi diproduksi sesudah host diinjeksi dengan antigen.  Respon antibodi merupakan puncak dari serangkaian interaksi antara makrofag, sel T, sel B terhadap hadirnya antigen asing.  Tahap pertama dari respon antibodi dimulai dari fagositosis antigen oleh makrofag atau sel lain dalam system retikuloendotelial yang meliputi sel-sel Langerhans di kulit, sel dendritik pada spleen dan lymph node, serta monosit dalam darah.  Sel-sel tersebut berdasarkan fungsi imunologisnya digolongkan sebagai antigen-presenting cells (APC).
Produksi antibodi diawali dengan melakukan injeksi atau imunisasi pada host atau hewan coba. Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam hal ini yaitu penanganan dan pemilihan hewan coba, cara injeksi, sifat dan dosis antigen.
Kualitas suatu antibodi dinilai dari beberapa hal, yaitu: konsentrasi kemurnian dan spesifisitas.  Untuk menentukan kemurnian biasanya dipakai teknik elektroforesis.  Beberapa teknik biasanya digabung untuk menentukan spesifitas sepeti kemampuan antibodi bereaksi dengan protein lain atau protein yang serupa dari spesies lain.

Elektroforesis protein

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik.  Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.  Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).  Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan.  Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = poly-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.
Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut.  Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya.  Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya.

Dasar-dasar Protein

Protein berasal dari bahasa Yunani proteios yang berarti pertama atau utama.  Protein merupakan makromolekul yang menyusun lebih dari separuh bagian dari sel.  Protein menentukan ukuran dan struktur sel, komponen utama dari sistem komunikasi antar sel serta sebagai katalis  berbagai reaksi biokimia di dalam sel.  Karena itulah sebagian besar aktivitas penelitian biokimia tertuju pada protein khususnya hormon, antibodi dan enzim.
Semua jenis protein terdiri dari rangkaian  dan kombinasi dari 20 asam amino.  Setiap jenis protein mempunyai jumlah dan urutan asam amino yang khas.  Di dalam sel, protein terdapat baik pada membran plasma maupun membran internal yang menyusun organel sel seperti mitokondria, retikulum endoplasma, nukleus dan badan golgi dengan fungsi yang berbeda-beda tergantung pada tempatnya. Protein-protein yang terlibat dalam reaksi biokimiawi sebagian besar berupa enzim banyak terdapat di dalam sitoplasma dan sebagian terdapat pada kompartemen dari organel sel.
Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen.  Ketika berada di luar makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak stabil.  Untuk mempertahankan fungsi dan nya, setiap jenis protein membutuhkan kondisi tertentu ketika diekstraksi dari normal biological milieu.  Protein yang diekstraksi hendaknya dihindarkan dari proteolisis atau dipertahankan aktivitas enzimatiknya.

Dasar-dasar isolasi protein

Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen.  Ketika berada di luar makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak stabil.  Untuk mempertahankan fungsi dan nya, setiap jenis protein membutuhkan kondisi tertentu ketika diekstraksi dari normal biological milieu.  Protein yang diekstraksi hendaknya dihindarkan dari proteolisis atau dipertahankan aktivitas enzimatiknya.
Untuk menganalisa protein yang ada di dalam sel tersebut, diperlukan prosedur  fraksinasi sel yaitu (1) memisahkan sel dari jaringannya, (2) menghancurkan membran sel untuk mengambil kandungan sitoplasma  dan  organelnya  serta (3) memisahkan organel-organel dan molekul penyusunnya.  Prosedur (1) dan (2) dinamakan homogenasi dapat dilakukan dengan menggunakan alat yang paling sederhana seperti homogeniser atau mortal sampai alat yang paling mutakhir seperti pemakaian vibrasi dan sonikasi tergantung pada bahan yang akan dihomogenasi. Prosedur (3) dilakukan dengan menggunakan sentrifus dengan kecepatan dan lama sentrifugasi tertentu.
Sebagian besar protein merupakan molekul yang mudah rusak bila tidak berada pada kondisi fisiologisnya.  Karena itu, untuk mempertahankan struktur dan fungsi protein, fraksinasi dilakukan pada suhu rendah (0-40C) dalam buffer dan pH tertentu (tergantung dari jenis protein yang akan dianalisa).

Beberapa teknik analisa protein membutuhkan prosedur isolasi yaitu memisahkan protein dari makromolekul yang lain atau memisahkan protein dengan sifat tertentu dari protein lain yang tidak diinginkan dalam analisa. Suatu teknik isolasi dan identifikasi protein harus mempertimbangkan sifat-sifat fisik, kimiawi dan kelistrikan suatu protein sedemikian rupa sehingga konformasi dan aktifitasnya tidak berubah.  Pada tahap awal isolasi, biasanya digunakan metode yang memiliki daya pemisah terendah seperti pengendapan dengan amonium sulfat.  Pengendapan ini dipengaruhi oleh berbagai faktor antara lain jumlah dan posisi gugus polar, berat molekul, pH dan temperatur larutan